Recogida y análisis de muestras de leche: el primer paso para el diagnóstico
Emili Calvet, Rafael Ortega y Juan Echevarria
Fuente: Guía Solomamitis del asesor en calidad del leche
En las diferentes situaciones y problemas a los que nos enfrentamos en calidad de leche en las explotaciones, siempre debemos buscar un diagnóstico como primer paso para solucionar la causa.
Aunque a lo largo del tiempo se ha evolucionado disponiendo de nuevas herramientas diagnósticas, sobre todo con la ayuda de la informática, una parte importante de la información sigue teniendo su origen en el laboratorio.
La importancia del laboratorio se relaciona principalmente con la microbiología de la leche, ya que la mayor parte de las alteraciones de la leche o bien de las patologías asociadas a esta tienen un origen bacteriano. Por tanto, disponer de un laboratorio de confianza a nuestro alcance para el procesado de las muestras obtenidas es fundamental para poder trabajar en calidad de leche. Pero no debemos olvidar el papel de otras herramientas de las que podemos disponer, de forma complementaria, sin necesidad de llevar muestras al laboratorio.
Los muestreos en las explotaciones siempre van orientados a obtener información para elaborar un diagnóstico de un problema existente, o bien a obtener información continua de algún parámetro de la granja que puede ser un punto crítico en la producción de leche de calidad.
Por tanto, la elección del tipo de muestra a recoger y del procedimiento de muestreo son fundamentales para poder interpretar los resultados correctamente y que no nos lleven a errores en el diagnóstico.
Es muy importante poder conseguir las muestras de forma fácil, sobre todo cuando se trata de muestreos continuos en el tiempo. Por tanto, los muestreos y el envío de las muestras al laboratorio deben de ser lo más sencillos posible y que se puedan transportar de la forma más correcta sin romper la cadena de frío.
Según los objetivos debemos considerar los diferentes tipos de muestra de leche:
- Muestras de leche de tanque.
- Muestras de leche secuenciadas durante el ordeño.
- Muestras de leche de vacas individuales.
En este artículo nos ocuparemos de las muestras de leche de tanque.
Muestra de leche del tanque
Es una herramienta de diagnóstico para múltiples problemas (actuales o potenciales) que pueden existir en la explotación relacionados con la calidad de la leche y con los patógenos causantes de mastitis (Quist et al., 2008; Hortet y Seegers, 1998). Nos aporta información de la leche producida por todos los animales que están en producción en la explotación en el momento del muestreo. Es un muestreo rápido, sencillo y barato. Sin embargo, debemos de tener en cuenta la información que nos puede aportar.
El mayor inconveniente es el efecto dilución cuando se usa como diagnóstico en microbiología, pero podemos intentar compensarlo mediante la toma de muestras de leche de los diferentes ordeños, o diferentes días para obtener una muestra más completa de leche y aumentar la fiabilidad de los resultados de la muestra recogida.
Toma de muestra de leche: la toma de muestras debe realizarse siempre por la parte superior del tanque, de forma aséptica y en un recipiente estéril, previa agitación de la leche de entre 5 a 10 minutos (Suriyasathaporn et al., 2000) si el ordeño lleva más de una hora finalizado (leche refrigerada) (Ruegg, 2003).
La cantidad de la muestra mínima debe ser de unos 50 ml pero depende de la analítica solicitada.
La frecuencia del análisis de la leche del tanque depende del objetivo. Si es un muestreo de diagnóstico, seguramente necesitaremos una muestra de leche de forma semanal. Si son muestreos de seguimiento o monitorización, deberemos establecer una frecuencia que normalmente suele ser mensual o trimestral.
Conservante: A las muestras siempre se les debe añadir un conservante para evitar posibles contaminaciones bacterianas durante su trayecto hacia el laboratorio. El conservante normalmente suele ser azidiol (compuesto químico utilizado como bacteriostático).
Las muestras deben mantenerse refrigeradas hasta el laboratorio y nunca deben congelarse (Ruegg, 2003). De las muestras de leche de tanque recogidas se puede obtener la información descrita en los doce puntos siguientes:
1. Calidad bacteriológica de la leche
Es un parámetro general que nos indica la contaminación bacteriana externa de la leche. Se utiliza para el pago por calidad en la recogida de la leche en origen. Nos indica la cantidad de gérmenes bacterianos que contiene la muestra de leche obtenida.
Otros parámetros utilizados para identificar el potencial de contaminación bacteriana de la leche en el campo, que aporta pérdida de calidad bacteriológica, son (Nymann et al., 2008):
- SPC (standard plate count): es el recuento bacteriano de la muestra de leche realizado en una placa o medio de cultivo. Es una estimación del número total de bacterias aerobias presentes en la leche. El resultado se expresa en número de UFC/ml. Esta técnica no nos da información sobre el fallo específico de higiene ni identifica el tipo de gérmenes dominantes en la muestra, solo nos indica cambios en la producción, recogida y almacenaje o bien la contaminación ambiental (Dohoo y Martin, 1984).
Las muestras deben procesarse dentro de las 36 horas después de la recogida. Es una prueba obligatoria oficial para las muestras tomadas en las explotaciones en el momento de recoger la producción de leche en las ganaderías, aunque actualmente ya se usan técnicas más modernas de evaluación en línea, como el Bactoscan® (Foss, North America, 2008), que es el sistema más utilizado en los laboratorios interprofesionales. - PIC (preliminary incubation count): nos indica el número total de bacterias capaces de crecer a menos de 7 °C, en situaciones en las que hay fallos en el sistema de refrigeración y la leche no se mantiene o no está a la temperatura correcta de mantenimiento. Es un muestreo específico para el diagnóstico de las bacterias psicrófilas.
- LPC (laboratory pasteurized count): es el recuento de bacterias termodúricas, las que resisten la temperatura de pasteurización de la leche a 62,8 °C durante 30 minutos. Este proceso destruye la mayoría de gérmenes contaminantes de la leche, especialmente los causantes de mastitis. Las muestras deben procesarse dentro de las 36 horas después de la recogida. No es un muestreo oficial, y se usa como diagnóstico y monitorización de la calidad bacteriológica de la leche en granja. Son bacterias que pueden cambiar el olor y el sabor o bien acortar la vida de la leche o de los productos elaborados.
- Contaje de coliformes: estima el número de bacterias del tipo coliformes existentes en la muestra, que generalmente tienen origen en la contaminación del entorno o bien en la falta de limpieza de los animales (Lewis, 1957). Es una prueba utilizada para el control del manejo en la sala de ordeño y así monitorizar la limpieza de las ubres de las vacas antes del ordeño.
2. Presencia y recuento microbiológico de gérmenes causantes de mastitis
Es muy utilizado sobre todo para el seguimiento y control de gérmenes causantes de mastitis contagiosas. Solo podemos interpretar los resultados como presencia o ausencia de los gérmenes en las ubres de animales infectados y como una aproximación a la cantidad de animales infectados, pero de una forma muy preliminar.
El motivo es el efecto dilución de los microorganismos sobre la cantidad total de leche existente en el tanque y las posibilidades de excreción intermitente de los gérmenes por parte de los animales infectados. Actualmente, el concepto y uso del cultivo microbiológico de leche de tanque posiblemente va a cambiar por las pruebas de PCR, ya que aumentan mucho la sensibilidad y especificidad de los resultados obtenidos. Las muestras deben procesarse también dentro de las primeras 36 horas desde la recogida. Se puede diagnosticar todo tipo de gérmenes pero los más importantes son:
- Streptococcus agalactiae: es excretado en gran número por los animales infectados y de fácil cultivo en la leche de tanque. La forma más frecuente de introducir el germen en las explotaciones sanas es mediante la compra de animales adultos, especialmente en lactación. El cultivo de leche de tanque es muy útil para el seguimiento y control de este agente en las explotaciones que no están cerradas a ganado foráneo.
- Staphylococcus aureus: su primer hábitat normal es la ubre infectada de las vacas. Siempre se encuentra en la superficie de la piel de los pezones y en heridas, que facilitan la infección de los animales. Las infecciones causadas suelen ser crónicas o subclínicas, aunque ocasionalmente pueden presentar síntomas clínicos (Suriyasathaporn et al., 2000).
- Mycoplasma: presenta dificultades para cultivarse en placa y su diagnóstico es más complicado. Se suele identificar antes en cultivos individuales de vacas con mastitis clínicas.
- Prototheca: esta alga está presente en explotaciones con dificultades para mantener una buena higiene en los tratamientos intramamarios de mastitis, con aguas contaminadas o ambientes poco controlados en ventilación e higiene. Siempre está relacionada con animales crónicos. Existe una excreción importante en número, pero de forma intermitente.
3. Recuento de células somáticas
Es un muestreo obligatorio para definir la calidad celular de la leche de tanque de la explotación y la base del control de mastitis en la explotación.
Siempre hay que relacionarlo con la incidencia de mastitis clínicas y subclínicas. Es el indicador general de la calidad celular de una granja. Es muy importante la forma de muestrear la leche del tanque. El análisis laboratorial suele realizarse mediante sistemas electrónicos en línea, con un análisis continuo en todas las recogidas de leche en las granjas.
La interpretación del resultado, para tener en cuenta la calidad del muestreo realizado, siempre está muy ligada al porcentaje de grasa de la muestra. Es decir, si el porcentaje de grasa de la muestra sigue la tendencia general de las últimas muestras, nos indica con bastante seguridad que la muestra está bien tomada. Si no es así, nos tenemos que plantear la posibilidad de tener una muestra atípica. Y de esta forma, podemos aventurarnos a decir que el recuento celular de la muestra no es correcto.
4. Calidad fisicoquímica de la leche
Los parámetros más habituales son el porcentaje de grasa y el porcentaje de proteína. Además, podemos disponer del porcentaje de lactosa, el extracto seco magro (ESM), el porcentaje de ácidos grasos (saturados e insaturados) y el porcentaje de caseína, entre otros. Se utiliza como forma de pago por calidad de la leche producida en las explotaciones. Por tanto, el porcentaje de grasa y proteína es un muestreo obligatorio para el pago por calidad de la leche. La agitación de la leche antes de tomar la muestra es muy importante para obtener el porcentaje de grasa real existente. Es el parámetro más dependiente de la homogeneidad de la leche y de la forma de tomar la muestra. Pero no afecta al resto de parámetros debido a su distribución homogénea en el total de la leche producida o almacenada en el tanque de refrigeración.
No nos debemos olvidar de la urea en las muestras de leche. Es un análisis que se va generalizando y que en principio no afecta a la calidad de la leche, pero sí que ayuda mucho en el manejo de la alimentación de los animales en las granjas.
5. Punto crioscópico de la leche
Parámetro obligatorio utilizado para conocer si hay adulteración de la leche mediante la adición de agua. El análisis se basa en la detección del punto de congelación de la muestra de leche. El punto de congelación límite para asegurar que una muestra de leche no tiene agua añadida es −0,520 °C. Si la muestra de leche tiene añadido algún conservante nos puede variar el punto de congelación.
6. Presencia de inhibidores
El objetivo es detectar muestras de leche que contienen algún tipo de sustancia inhibidora de un crecimiento bacteriano específico. En general, se utiliza para detectar la presencia de antibióticos en la leche. Es un parámetro de uso obligatorio en todas las muestras de leche que llegan al laboratorio y en la entrada de la leche en todas las industrias lácteas.
Se utiliza también de forma sistemática en las explotaciones antes de cargar la leche con destino hacia la industria. Los análisis utilizados son diversos, pero en general están las pruebas cortas de cinco minutos (enzimáticas) y las pruebas largas de tres horas (microbiológicas).
Los análisis de inhibidores deben efectuarse sobre muestras obtenidas en un corto intervalo de tiempo (horas) si se mantienen refrigeradas. Si congelamos las muestras, estas se mantienen más tiempo, permitiendo extraer resultados fiables de las pruebas, ya que la congelación no anula el efecto antibiótico de la muestra. El azidiol como conservante de la muestra de leche no interfiere en las pruebas de inhibidores más utilizadas. Existen otros conservantes en los que debe evaluarse su actividad a la hora de realizar estas pruebas.
7. Estabilidad de la leche, prueba del alcohol y pH
Para la realización de estas pruebas en el laboratorio se necesita una muestra de leche representativa de la explotación. El volumen normal son 50 ml, que es cantidad suficiente. En general son análisis poco utilizados y de difícil interpretación en muchas ocasiones, debido a la gran cantidad de factores que pueden hacer variar los resultados. Habitualmente son pruebas de campo que se pueden realizar en la propia granja ante la sospecha de posibles problemas. Las consideramos como pruebas de orientación que nos ayudan a evaluar la calidad de la leche.
8. PCR (polymerase chain reaction)
Es una prueba de futuro por su fiabilidad. Actualmente se utiliza para el diagnóstico de diferentes patógenos, principalmente contagiosos, en la muestra de leche. Las muestras pueden contener conservante y se pueden congelar. Es una herramienta muy importante para establecer la calidad celular y en la calidad higiénica de la leche.
9. Lipólisis
Una muestra de leche de tanque se puede utilizar también para el diagnóstico de factores que pueden influir sobre el cálculo del porcentaje de grasa en la leche. En los sistemas de medición actuales, se evalúan los glóbulos de grasa existentes en la muestra. Si estos glóbulos se rompen por diferentes motivos, se produce el efecto lipólisis en la leche. La lipólisis afecta a la calidad de los productos acabados, a la duración de los mismos y al sabor de la leche, entre otros parámetros.
10. Aislamiento específico de bacterias
Estos análisis se llevan a cabo para aislar bacterias o grupos de bacterias que pueden afectar o estar implicadas en la seguridad alimentaria. Estas incluyen Salmonella spp., Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus (Gonda y Lindberg, 1994).
11. Producción bacteriana de enzimas
Se trata de métodos para evaluar la capacidad de algunos gérmenes para producir enzimas que alteran alguno de los principales componentes de la leche, como la grasa, la proteína o la caseína (Gonda y Lindberg, 1994). La consecuencia es la alteración de las características organolépticas de los productos o bien la variación de su
conservación.
12. Patógenos sistémicos
Son análisis de posibles patógenos de los animales con finalidades relacionadas con la bioseguridad mediante el método ELISA, fundamentalmente. Se basa en el diagnóstico de antígenos y anticuerpos de los animales en las muestras de leche del tanque. Así, por ejemplo, algunos patógenos sobre los que se están desarrollando técnicas de diagnóstico en leche de tanque son: diarrea vírica bovina, Neospora, brucelosis, enfermedad de Johne (paratuberculosis), Salmonella, etc.
Bibliografía
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Gonda, H.L. and Lindberg, J.E. Evaluation of dietary nitrogen utilization in dairy cows based on urea concentration in blood, urine and milk, and on urinary concentration of purine derivatives. Acta agric. Scand. Sect. A. 1994; 44:236.
Horter P., Seegers, H. Loss in milk yield and related composition changes resulting from clinical mastitis in dairy cows. Prev. Vet. Med. 1998; 37:1-20.
Lewis, D. Blood-urea concentration in relation to protein utilization in the ruminant. J. Agric. Sci. (Camb.), 1957; 48:438.
Nyman, A.K., Emanuelson, U., Holtenius, K., Ingvartsen, K.L., Larsen, T., Persson Waller, K. Metabolites and immune parameters associated with somatic cell count in early lactation. NMC Annual Meeting Proceedings. 2008.
Quist, M.A., LeBlanc, S.J., Hand, K.J., Lacenby, D., Miglior, F., Kelton, D.F. Milking-to-Milking variability for Milk Yield, Fat and Protein Percentage and Somatic Cell Count. Journal of Dairy Science. 2008; vol. 91, issue 9. Septembre: 3412-3423.
Ruegg, P.L. Investigation fo mastitis problems on farms. The Veterinary Clinics Food Animal Practice. 2003; 19:47-73.
Suriyasathaporn, W., heuer, C., Noordhuizen-Stassen, E.N., Schukken, Y.H. Hyperketonemia and the impairment of udder defen